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           技術文章
          TUNEL細胞凋亡試劑盒參考操作步驟
          作者:江蘇鎮江厚普生物科技有限公司  來源:  發表時間:[2011-11-4]  點擊:3969

          一、TUNEL細胞凋亡試劑盒內容

          凋亡細胞的原位末斷轉移酶標記法(TUNEL法)

              細胞凋亡的多步驟機制作用的最終環節是:細胞內源性核酸內切酶的激活而導致核染色質DNA雙鏈的斷裂。大量DNA片段暴露出的3’-羥基在末斷轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)DNA多聚酶的作用下,與生物素或地高辛標記的核苷酸結合,最終借助與卵白素或抗地高辛抗體結合的熒光素或HRP,使凋亡細胞被特異性地標記和顯示出來。

              TUNEL細胞凋亡試劑盒由Roche公司提供

              試劑1 酶濃縮溶液(Enzyme Solution),10×濃縮液;

              試劑2 標記溶液(Lable Solution),1×濃縮液;

            試劑3 轉化劑-PODConverter-POD),酶標記抗熒光素抗體(即用型)。

          自備試劑:

          PBS、

          雙蒸水、

          二甲苯、

          梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、

          DAB工作液(臨用前配制,5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、

          Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8)或細胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,臨用前配制)、

          蘇木素或甲基綠、

          DNase 13000 U/ml3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,pH 7.5,10 mM MgCl2,1 mg/ml BSA)等。

          操作流程圖:制作石蠟切片脫蠟、水合細胞通透TUNEL反應液converter-POD→與底物DAB反應顯色光學顯微鏡計數并拍照。

          二、TUNEL細胞凋亡試劑盒參考操作步驟:

          1. 用二甲苯浸洗2次,每次5min;

          2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;

          3. PBS漂洗2次;

          4. Proteinase K工作液處理組織15-30 min 21–37°C(溫度、時間、濃度均需摸索)或者加細胞通透液8min;

          5. PBS漂洗2次;

          6. 制備TUNEL反應混合液,處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標記的dUTP液混勻;而陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液,陽性對照組先加入100μl DNase 1,反應在15~25℃×10min,后面步驟同處理組。

          7. 玻片干后,加50μl TUNEL反應混合液(陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液)于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1h。

          8. PBS漂洗3次;

          9. 可以加1PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞(激發光波長為450~500nm,檢測波長為515~565nm);

          10. 玻片干后加50μl converter-POD于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。

          11. PBS漂洗3次;

          12. 在組織處加50~100μl DAB底物,反應15~25℃×10min;

          13. PBS漂洗3次;

          14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復染,幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

          15. 加一滴PBS或甘油在視野下,用光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200~500個細胞)并拍照?山Y合凋亡細胞形態特征來綜合判斷(未染色細胞變小,胞膜完整但出現發泡現象,晚期出現凋亡小體,貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落;而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質分割成塊狀/凋亡小體)。

          三、 注意事項

          1. 進行PBS 清洗時,每次清洗5 min。

          2.  PBS清洗后,為了各種反應的有效進行,請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應。

          3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后,請蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進行,這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。

          4. TUNEL反應液臨用前配制,短時間在冰上保存。不宜長期保存,長期保存會導酶活性的失活。

          5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配制。

          6. 用甲基綠(Methyl Green)染液(3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 pH4.0)染色后,請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈(100%乙醇)、脫水(二甲苯)透明、封片后通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時,甲基綠比較容易脫色,注意快速進行脫水操作。

          7. 熒光素標記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物,可通過吸入、口服等途徑進入機體,注意防護。

          8. 試劑保存:未打開的試劑盒貯存在-20℃-15~25℃);converter -POD液一旦解凍,以后就保存在4℃2~8℃)下,至少在6 個月內穩定,避免再次凍存;TUNEL反應液臨用前配好后,放至冰上直至使用。

          9. 結果分析時注意:在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產生大量DNA片斷,從而引起假陽性結果;而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全,以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內反應,進而產生假陰性結果。

           

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