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       技術文章
      免疫熒光參考實驗步驟
      作者:江蘇鎮江厚普生物科技有限公司  來源:  發表時間:[2011-11-4]  點擊:5871

      一、細胞免疫熒光

      1. 細胞爬片;

      2. 冷丙酮4固定15min(或用4%多聚甲醛室溫固定10~20min);

      3. 空氣干燥5min,PBS漂洗3min,3次;

      4. 細胞通透:0.5% Triton X-100(溶于PBS)通透細胞,室溫15~30min(丙酮固定法不用此步驟);

      5. PBS漂洗2次,每次5min;

      6. 3% H2O2去離子水室溫孵育10min,PBS洗;

      7. 正常山羊血清封閉,37孵育10~20min,甩掉封閉液,勿洗;

      8. 加適當比例的一抗工作液孵育,4過夜或37 1~2h;

      9.  PBS漂洗2次,每次5min;

      10. 加入熒光二抗工作液,37,30-60min;

      11. PBS漂洗2次,每次5min;

      12. DAPI染色2~5min,PBS漂洗2次,每次5min;

      13. 抗淬滅封片劑封片;

      14. 熒光顯微鏡觀察,拍片。

      二、冰凍切片

      1. 冰凍切片室溫放置30分鐘后,入4丙酮固定10分鐘,也可根據需要選擇其他方式。PBS洗,5min,3次;

      2. 3% H2O2去離子水37孵育10min,PBS洗,5min,2次;

      3. 510%正常山羊血清封閉,37孵育10-20min,傾去血清,勿洗;

      4. 適當比例的一抗工作液孵育,4過夜或37 12h;

      5. 復溫20min,PBS3min,三次;

      6. 加入熒光二抗工作液,37,30-60min;

      7. PBS漂洗2次,每次5min;

      8. DAPI染色2~5min,PBS漂洗2次,每次5min;

      9. 抗淬滅封片劑封片;

      10. 熒光顯微鏡觀察,拍片。

      三、石蠟切片

      1. 常規石蠟切片60烤片2小時;

      2. 脫蠟。二甲苯脫蠟15min,兩次;

      3. 水化。依次用無水乙醇、95%、90%、80%、70%,各一次2min,之后在蒸餾水中孵育5min;

      4. 1×PBSpH7.4)浸泡5min;

      5. 抗原修復:高壓修復(EDTA,pH8.00.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液,pH6.0高壓10-15min),PBS2-3min;

      6. 3% H2O2去離子水37孵育10min,PBS洗;

      7. 正常山羊血清封閉,37孵育10-20min,勿洗;

      8. 適當比例的一抗工作液孵育,4過夜或37 1h;

      9. 復溫20min,PBS3min,三次;

      10. 加入熒光二抗工作液,37,30-60min;

      11. PBS漂洗2次,每次5min;

      12. DAPI染色2~5min,PBS漂洗2次,每次5min;

      13. 抗淬滅封片劑封片;

      14. 熒光顯微鏡觀察,拍片。

       

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