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           技術文章
          冰凍切片參考實驗步驟
          作者:江蘇鎮江厚普生物科技有限公司  來源:  發表時間:[2011-10-29]  點擊:3608

          切片制備:將組織塊平放于軟塑料蓋或特制小盒內(直徑2cm),如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內,當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰,此時小盒保持原位切勿浸入液氮內,大約10-20秒組織即迅速冰凍成塊。取出組織冰塊立即置入-80冰箱儲存備用,或置于恒冷切片機冰凍切片。冰凍切片4~8mm,冰凍切片后如不染色,必須吹干,儲存低溫冰箱內,或進行短暫預固定后儲存冰箱內保存。

          1. 冰凍切片室溫放置30分鐘后,入4丙酮固定10分鐘,也可根據需要選擇其他方式。PBS洗,5min,3次;

          2. 3% H2O2去離子水37孵育10min,PBS洗,5min,2次;

          3. 510%正常山羊血清封閉,37孵育10-20min,傾去血清,勿洗;

          4. 適當比例的一抗工作液孵育,4過夜或37 12h;

          5. 復溫20min,PBS3min,三次;

          6. 二抗孵育:加生物素化標記二抗,37,10-15min,PBS3min,三次;

          7. 三抗孵育:加辣根酶標記的鏈酶卵白素,37,10-15min,PBS3min,三次;

          8. DAB顯色劑顯色(或AEC顯色),鏡下觀察結果,適時終止;

          9. 蘇木素復染5min,自來水沖洗片刻,75%的鹽酸酒精溶液分化30s,自來水沖洗5min藍化;

          10. 脫水。依次經過70%、80%、90%、95%、無水乙醇,各2min,二甲苯15min,三次;

          11. 封片,中性樹膠封片。

          光學顯微鏡100×或400×觀察,拍片。

          圖象評分。
           

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